jenabioscience:Atto425 NT Labeling Kit  貨號：PP-305L-425

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學家于1998年成立，利用超過25年的學術知識為100多個國家的研究和行業(yè)客戶開發(fā)創(chuàng)新試劑。

供一般實驗室使用。

運輸:凝膠包裝運輸

儲存條件:儲存在-20°C
避免冷凍/解凍循環(huán)，避光儲存

保質(zhì)期:12個月

光譜特性: λexc436納米，λ全身長的484納米，ε 45.0毫摩爾-1厘米-1(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH 7.5)

描述:
Atto425缺口翻譯標記試劑盒包含缺口翻譯標記所需的所有試劑(除了用于純化探針的模板和材料),提供了一種高效、易于實施和快速的標記技術。
該試劑盒被推薦用于DNA的直接酶標記。Atto425 NT標記混合物包含經(jīng)過特別優(yōu)化的Atto425-dUTP，可通過DNA聚合酶I進行缺口翻譯，從而整合到DNA中。熒光團出色的穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率，加上染料-dUTP復合物的高整合率，使其成為各種熒光應用的理想選擇。
缺口翻譯標記基于聚合酶I和脫氧核糖核酸酶I的反向活性。脫氧核糖核酸酶I能夠在低酶濃度下將隨機分布的缺口引入雙鏈DNA。聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性從缺口的3’側去除核苷酸，同時使用3’-OH末端作為引物合成部分新的互補鏈。在存在染料標記的dUTP聚合酶的情況下，I摻入標記的dUTP而不是dTTP。酶混合物中平衡良好的聚合酶/核酸酶活性確保了高度標記的雙鏈DNA片段的產(chǎn)生。
所得DNA適用于FISH、微陣列基因表達譜和其他核酸雜交分析。
保護熒光標記的dUTP免受光照射，并在弱光條件下進行實驗程序。

內(nèi)容:
酶混合物(紅色瓶蓋)
儲存緩沖液中的2單位/微升聚合酶I和0.02單位/微升脫氧核糖核酸酶I

NT標記緩沖液(綠色瓶蓋)
10倍濃度

Atto425 NT標簽混合物(紫色瓶蓋)
0.5毫米dATP、0.5毫米dCTP、0.5毫米dGTP、0.25毫米dTTP、
0.25毫米Atto425-dUTP，pH 7.5

停止緩沖器(黃色蓋子)
0.5 M EDTA，pH 8.0

PCR級水(白色瓶蓋)

推薦的NT檢測:
樣品材料可以是超螺旋或線性化的質(zhì)粒DNA、粘粒或BAC DNA、完整或部分染色體或純化的PCR產(chǎn)物。
在無菌小瓶中制備以下反應混合物。
20 μl缺口翻譯標記分析

• 輕輕渦旋混合物以確保均勻，并短暫離心以收集試管底部的反應混合物。
• 將試管置于15°c預冷的熱混合器中。建議孵育90分鐘，以產(chǎn)生大小在200和500 bp之間的DNA片段。
• 為了控制片段的長度，在瓊脂糖凝膠上加載2 μl分析物。運行凝膠時，將反應管置于-20°C。
• 為了獲得更小的片段，添加額外的2 μl酶混合物，并在15℃下延長孵育時間
• 為最終終止反應，添加5 μl終止緩沖液(黃色瓶蓋)。進行純化或儲存在-20°c下

探針的純化:
為了在反應混合物用于后續(xù)實驗之前從反應混合物中除去未摻入的核苷酸，建議采用以下程序之一:
1.硅膠膜吸附純化- PCR純化試劑盒。不，第201頁
Jena Bioscience PCR純化試劑盒提供了一種簡單有效的方法來純化大于100 bp的DNA片段。該制劑基于二氧化硅膜技術，用于在高鹽中結合DNA，并在低鹽緩沖液中洗脫。請參考說明書。
2.異丙醇沉淀提純
向反應混合物中加入1 μl糖原(2 mg/ml)、2 μl乙酸鈉(3 M)和14 μl異丙醇，并輕輕充分混合。室溫下孵育15分鐘，并在4℃下以最大速度旋轉30分鐘。棄去上清液，用70 %乙醇洗滌2次(以最大速度旋轉5分鐘)。
3.離心過濾裝置凈化
未摻入的核苷酸可以用離心過濾裝置通過離心去除。根據(jù)DNA片段的截止值選擇過濾器裝置，并遵循制造商的說明。

熒光團的摻入率:
DNA標記的效率可以通過計算摻入的熒光團與片段中堿基數(shù)量的比率(染料/堿基)來估計。
1.光密度的測量:測量標記的DNA片段在260 nm處的吸光度(A260)和激發(fā)最大值(λexc)為染料(A給…染色).
2.A的校正260閱讀:為了獲得核酸的精確吸光度測量，必須校正260 nm處染料的貢獻。使用以下等式:
A基礎= A260-(答給…染色x CF260)
Atto425的校正系數(shù):CF260 = 0.27
3.標記率的計算:染料與堿的比例由下式給出:
染料/堿= (A給…染色x ε基礎)/ (A基礎x ε給…染色)
消光系數(shù):
Atto425: ε給…染色= 45000厘米-1 M-1
dsDNA: ε基礎= 6600厘米-1 M-1
ssDNA: ε基礎= 8900厘米-1 M-1
寡核苷酸:ε堿基= 10000cm-1 M-1
實施例:染料與堿基之比為0.05對應于將10個dye-dUTP核苷酸分別摻入到含有200個核苷酸的DNA片段中，或者摻入到100 bp的PCR片段中。如果可以假設dATP、dCTP、dGTP和dTTP在DNA片段中的平均分布，50個現(xiàn)有dttp中的10個已經(jīng)被dye-dUTP取代，導致20 %的標記率。

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