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丙酮酸脫氫酶(PDH)測試盒

簡要描述:丙酮酸脫氫酶(PDH)測試盒 上海牧榮生物科技有限公司專業(yè)實驗室產(chǎn)品.為客戶全面解決實驗、生產(chǎn)、開發(fā)需求,提供方便、快捷的服務。丙酮酸脫氫酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)試劑盒

  • 產(chǎn)品型號:
  • 廠商性質(zhì):代理商
  • 更新時間:2024-05-06
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詳細介紹

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應用領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),制藥

丙酮酸脫氫酶(PDH)測試盒

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

PDH(EC 1.2.4.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,催化丙酮酸脫梭生成羥*基-TPP,把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。

測定原理

PDH催化丙酮酸脫氫,同時還原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),從而導致600nm光吸收的減少。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:100mL×1瓶,-20℃保存;

試劑二:20mL×1瓶,-20℃保存;

試劑三:1.5mL×1支,-20℃保存;

試劑四:液體20mL×1瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存;

樣本的前處理

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

  1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

  2. 將勻漿600g,4℃離心5min。

  3. 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

  4. 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的PDH(此步可選做)。

  5. 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體PDH活性測定。

測定步驟

  1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至605nm,蒸餾水調(diào)零。

  2. 樣本測定

(1)在試劑五中加入19mL試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑五,混勻,立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和 1min后的吸光值A(chǔ)2,計算ΔA=A1-A2。

PDH活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

 PDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

 PDH活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。



上海牧榮生物科技有限公司

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丙酮酸脫氫酶(PDH)測試盒






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