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α酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)測試盒

簡要描述:α酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)測試盒 上海牧榮生物科技有限公司專業(yè)實驗室產(chǎn)品。α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性測定試劑盒

  • 產(chǎn)品型號:
  • 廠商性質:代理商
  • 更新時間:2024-05-06
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詳細介紹

品牌其他品牌供貨周期現(xiàn)貨
應用領域醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),制藥

α酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)測試盒

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

α-KGDH(EC 1.2.4.2)廣泛存在于動物、植物微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,是三羧酸循環(huán)調控關鍵酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。

測定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:100mL×1瓶,-20℃保存;

試劑二:20mL×1瓶,-20℃保存;

試劑三:1.5mL×1支,-20℃保存;

試劑四:液體20mL×1瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×1瓶,-20℃保存;

試劑六:粉劑×1支,-20℃保存;

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

  1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

  2. 將勻漿600g,4℃離心5min。

  3. 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

  4. 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH(此步可選做)。

  5. 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體α-KGDH活性測定。

測定步驟

  1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至340nm,蒸餾水調零。

  2. 樣本測定

(1)在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min;現(xiàn)配現(xiàn)用;

(2)在試劑六中加入1mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五,混勻,立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。

α-KGDH活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=650×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。


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α酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)測試盒


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