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雙染法免疫熒光組織化學(xué)染色步驟

更新時(shí)間:2023-08-08      點(diǎn)擊次數(shù):3080

如果同一標(biāo)本中需要同時(shí)顯示A、B兩種抗原,則A抗原的抗體用FITC標(biāo)記,B抗原的抗體用TRITC標(biāo)記,可采用以下染色方法用過的:

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙染

原代培養(yǎng)的大鼠端腦細(xì)胞第14天胚胎:在成骨形態(tài)蛋白的誘導(dǎo)下,乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(綠色熒光)和同源結(jié)構(gòu)域蛋白Islet-1(紅色熒光)共存于細(xì)胞質(zhì)中(激光掃描共存)。聚焦顯微鏡觀察)

1.一步雙染法,將兩種熒光標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例(A+B)混合,按照直接法進(jìn)行染色。

2.兩步雙染法,先用TRITC標(biāo)記的抗體A進(jìn)行免疫熒光染色,然后用FITC標(biāo)記的抗體B進(jìn)行免疫熒光染色。根據(jù)兩種抗體的動(dòng)物種類,可以采用直接法或間接法。結(jié)果是A抗原呈橙紅色熒光,而B抗原呈黃綠色熒光。在應(yīng)用中,常用的方法是免疫熒光組織化學(xué)中的間接法與熒光染料SABC-Cy3法的結(jié)合。例如,在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗,匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

進(jìn)行雙染時(shí),由于兩種一抗來源不同,可能會(huì)混合一抗。孵育后,清洗未結(jié)合的一抗。滴加二抗時(shí),先加入人生物素化抗兔IgG(二抗)孵育。清洗后,滴下 SABC-Cy3 復(fù)合物。特異性熒光,然后與FITC-抗小鼠IgG(二抗)孵育,最后封片觀察。結(jié)果,A抗原顯示綠色熒光,B抗原顯示紅色熒光。

該方法中需要注意的是,兩種一抗混合稀釋時(shí),抗體的終濃度應(yīng)為每種抗體的工作濃度。也就是說,混合液要同時(shí)滿足兩種一抗的工作濃度。如果兩個(gè)一抗來自同一物種,則必須進(jìn)行兩次雙染,即A抗原先用第一個(gè)一抗和第一個(gè)熒光二抗染色,然后用第二個(gè)一抗和第一個(gè)熒光二抗洗滌熒光二抗。 B抗原染色需使用兩種熒光二抗,否則會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng),導(dǎo)致染色不特異。


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